De genomiske sekvenser af de fleste vira har været kendt.Nukleinsyreprober, som er korte DNA-segmenter designet til at hybridisere med komplementære virale DNA- eller RNA-segmenter.Polymerasekædereaktionen (PCR) er en mere effektiv teknik til viruspåvisning.High throughput diagnostiske metoder er blevet udviklet for nylig.
A. Nukleinsyrehybridiseringsteknik
Nukleinsyrehybridisering, hovedsageligt inklusive Southern blotting (Southern) og Northern blotting (Northern), er en hurtig udvikling af ny teknik inden for virusdiagnostik.Begrundelsen for hybridiseringsassayet er at bruge korte DNA-segmenter (kaldet "probe") designet til at hybridisere med komplementære virale DNA- eller RNA-segmenter.Ved opvarmning eller alkalisk behandling adskilles dobbeltstrenget mål-DNA eller RNA i enkeltstrenge og immobiliseres derefter på et fast underlag.Derefter tilsættes probe og hybridiseres med mål-DNA'et eller RNA'et.Da proben er mærket med isotop eller ikke-radioaktivt nuklid, kan mål-DNA'et eller RNA'et påvises ved autoradiografi eller af biotin-avidin-systemet.Da de fleste virale genomer er blevet klonet og sekventeret, kan de påvises ved hjælp af virusspecifikke sekvenser som prober i prøven.I øjeblikket omfatter hybridiseringsmetoderne: dot blot, in situ hybridisering i celler, DNA blotting (DNA) (Southern blot) og RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR teknologi
I de senere år er en række in vitro-nukleinsyreamplifikationsteknikker blevet udviklet baseret på PCR, for at teste ufølsomme eller ikke-dyrkbare vira.PCR er en metode, som kan syntetisere specifik DNA-sekvens ved in vitro polymerasereaktion.PCR-processen omfatter en termisk cyklus på tre trin: denaturering, annealing og forlængelse Ved høj temperatur (93℃~95℃) adskilles det dobbeltstrengede DNA i to enkelt DNA-strenge;derefter ved lav temperatur (37℃~60℃), annealer to syntetiserede nukleotidprimere til de komplementære DNA-segmenter;hvorimod ved den passende temperatur for Taq-enzym (72 ℃) starter syntese af nye DNA-kæder fra primer 3'ende ved brug af komplementært DNA som skabeloner og enkelte nukleotider som materialer.Så efter hver cyklus kan en DNA-kæde amplificeres til to kæder.Ved at gentage denne proces kan hver DNA-kæde syntetiseret i en cyklus bruges som skabelon i den næste cyklus, og antallet af DNA-kæder fordobles i hver cyklus, hvilket betyder, at produktionen af PCR amplificeres i en 2n log-hastighed.Efter 25 til 30 cyklusser identificeres produktionen af PCR gennem elektroforese, og de specifikke DNA-produkter kan observeres under UV-lys (254nm).Til fordel for specificitet, sensitivitet og bekvemmelighed er PCR blevet brugt til klinisk diagnose af mange virusinfektioner såsom HCV, HIV, CMV og HPV.Da PCR er meget følsom, kan den detektere virus-DNA på fg-niveau, bør operationen udføres meget omhyggeligt for at undgå falsk positiv.Derudover betyder positivt resultat i nukleinsyretest ikke, at der er levende infektiøs virus i prøven.
Med bred anvendelse af PCR-teknik udvikles nye teknikker og metoder baseret på PCR-teknik til forskellige testformål.For eksempel kan den kvantitative PCR i realtid detektere viral belastning;in situ PCR bruges til at identificere virusinfektion i væv eller celler;Den indlejrede PCR kan øge specificiteten af PCR.Blandt dem er realtids kvantitativ PCR blevet udviklet hurtigere.Mange nye teknikker, såsom TaqMan-hydrolyseprobe, hybridiseringsprobe og molekylær beacon-probe, er blevet kombineret i real-time kvantitativ PCR-teknik, som er meget udbredt i klinisk forskning.Udover at identificere virusmængden i patientens kropsvæske nøjagtigt, kan denne metode også bruges til at påvise lægemiddeltolerante mutanter.Derfor anvendes kvantitativ PCR i realtid hovedsageligt til evaluering af helbredende virkning og overvågning af lægemiddeltolerance.
C. High-throughput detektion af virale nukleinsyrer
For at imødekomme behovene for hurtig diagnosticering af nye infektionssygdomme, er der blevet etableret forskellige high-throughput detektionsmetoder, såsom DNA-chips (DNA).For DNA-chips syntetiseres specifikke prober og fæstnes til små siliciumchips i meget høj densitet for at danne DNA-probe-mikroarray (DNA), som kan hybridiseres med prøven.Hybridiseringssignalet kan afbildes med konfokalmikroskop eller laserscanner og behandles yderligere af computeren, og et stort datasæt vedrørende forskellige gener kan opnås.Der er to slags DNA-chip."Syntesechippen" er som følger: de specifikke oligonukleotider syntetiseres direkte på chipsene.En anden er DNA pool chip.De klonede gener eller PCR-produkter er ordnet udskrevet på objektglasset.Fordelen ved DNA-chipteknologi er den samtidige påvisning af en enorm mængde DNA-sekvenser.Den seneste version af patogendetektionschip kan identificere over 1700 menneskelige vira på én gang.DNA-chipteknologi løste problemerne med traditionelle nukleinsyrehybridiseringsmetoder og har meget brede anvendelser i viral diagnose og epidemiologisk undersøgelse.
Indlægstid: 23. december 2020